pTO-T快速克隆試劑盒利用拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。適用于克隆由Taq DNA聚合酶擴增的3'端帶有“A”末端的產物。載體元件包含高拷貝的復制子,Amp抗性基因,可以用引物對M13F(-47)和M13R(-48)進行菌落PCR鑒定陽性克隆。
組成 |
CL05020 |
CL05060 |
2×pTO-T Mix (每5ul Mix含30ng載體pTO-T) |
100ul |
100ul×3 |
Control Insert |
5ul |
5ul |
M13F引物(10uM) |
50ul |
150ul |
M13R引物(10uM) |
50ul |
150ul |
使用本試劑盒連接Control Insert(1kb),涂布于A抗性平板上,用菌落PCR或質粒酶切方法驗證次日長出的克隆,陽性克隆達到總克隆數90%及以上。
-20℃保存12個月,避免反復凍融
按下表,在一個0.2ml PCR管內依次加入
室溫下(20℃-30℃)放置5~10分鐘,然后將離心管放置在冰上。當天如不進行轉化實驗,請將連接產物置于-20℃保存。注意DNA片段的用量見下表:
如果PCR產物電泳檢測僅有單一條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取產物原液進行克隆。
取5ul試劑盒提供的1kb長度的對照片段進行克隆。
菌落PCR
用10ul槍頭挑選克隆至預先加有10ul無菌水或LB培養基的PCR管中,吹打混勻。取2ul細菌懸液為模板,50ul PCR體系中加入10uM濃度的M13F/M13R各1ul進行PCR擴增。
1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。電泳條帶大小與插入片段大小相近(由于M13引物在克隆位置的兩側,所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大156bp)的克隆可視為陽性克隆。菌落PCR鑒定重組體時一定要設立一個不加菌液的陰性對照,以排除PCR擴增的條帶為假陽性的可能。
測序:用M13F和M13R對陽性克隆的質粒進行測序分析。
產品名稱 | 產品編號 | 規 格 | 單位 | 價格(RMB) |
---|---|---|---|---|
pTO-T | CL05020 | 20次 | 盒 | 500元 |
pTO-T | CL05060 | 60次 | 盒 | 1380元 |
說明書 |