pTO-T快速克隆試劑盒
                          產品說明

                            產品概述:

                                   pTO-T快速克隆試劑盒利用拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。適用于克隆由Taq DNA聚合酶擴增的3'端帶有“A”末端的產物。載體元件包含高拷貝的復制子,Amp抗性基因,可以用引物對M13F(-47)和M13R(-48)進行菌落PCR鑒定陽性克隆。

                            產品組成:

                            組成

                            CL05020

                            CL05060

                            2×pTO-T Mix

                            (每5ul Mix30ng載體pTO-T

                            100ul

                            100ul×3

                            Control Insert

                            5ul

                            5ul

                            M13F引物(10uM)

                            50ul

                            150ul

                            M13R引物(10uM)

                            50ul

                            150ul

                            產品特點:

                          • 連接反應僅需5分鐘
                          • 體系配置簡單,只需加入片段和pTO-T Mix
                          • 適用于Taq DNA聚合酶擴增的3'端帶有“A”末端的產物
                          • 具有氨芐青霉素
                          • 無需藍白斑篩選,陽性率大于90%
                          • 質量控制檢測 :

                                   使用本試劑盒連接Control Insert(1kb),涂布于A抗性平板上,用菌落PCR或質粒酶切方法驗證次日長出的克隆,陽性克隆達到總克隆數90%及以上。

                            貯存

                                   -20℃保存12個月,避免反復凍融

                            使用說明

                            1、連接反應

                                按下表,在一個0.2ml PCR管內依次加入

                               

                            2、反應溫度及片段要求

                                   室溫下(20℃-30℃)放置5~10分鐘,然后將離心管放置在冰上。當天如不進行轉化實驗,請將連接產物置于-20℃保存。注意DNA片段的用量見下表:

                                

                                   如果PCR產物電泳檢測僅有單一條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取產物原液進行克隆。

                            3、陽性對照反應

                                   取5ul試劑盒提供的1kb長度的對照片段進行克隆。

                            4、 轉化


                          • 取10ul連接產物到100ul剛剛融化的DH5a或TOP10感受態細胞中(不建議使用TOP10F`感受態細胞),輕輕混勻,冰浴10-30分鐘。
                          • 42℃水浴中熱擊90秒。
                          • 立刻置于冰水浴中2分鐘。
                          • 加入500ul無菌的不含抗生素的SOC或LB液體培養基,37℃,200-250rpm振蕩培養60分鐘。
                          • 吸取200ul菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先4000rpm離心1分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后37℃培養過夜(12-16小時)

                          • 5、 陽性重組子的鑒定

                                   菌落PCR
                                   用10ul槍頭挑選克隆至預先加有10ul無菌水或LB培養基的PCR管中,吹打混勻。取2ul細菌懸液為模板,50ul PCR體系中加入10uM濃度的M13F/M13R各1ul進行PCR擴增。
                                   1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。電泳條帶大小與插入片段大小相近(由于M13引物在克隆位置的兩側,所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大156bp)的克隆可視為陽性克隆。菌落PCR鑒定重組體時一定要設立一個不加菌液的陰性對照,以排除PCR擴增的條帶為假陽性的可能。
                                   測序:用M13F和M13R對陽性克隆的質粒進行測序分析。

                            常見問題分析:

                            轉化次日平板克隆少,或陽性率低?


                          • 感受態效率低,使用轉化效率>5×107 cfu/ug的感受態細胞。
                          • 連接反應在低溫下操作,應當在室溫下操作。
                          • 連接反應時間過長,室溫下5分鐘就可以,時間過長,連接效率會下降。
                          • PCR片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。
                          • PCR純度低,切膠時在紫外燈下照射時間長,需重新制備。
                          • PCR擴增結束后,應該再延伸5-10分鐘,確保片段延伸完全。
                          • 轉化后沒有復蘇培養,可以加入SOC或LB液體培養基,培養60分鐘。
                          • 克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和DNA結合蛋白的基因,某些啟動子和調節序列基因,或含有倒置或串聯重復序列的基因,選用25-30℃室溫過夜培養,或者選擇轉化能夠有效針對毒性基因的EPI400感受態細胞。

                          • pTO-T載體圖譜和多克隆位點序列

                          產品內容
                            產品名稱 產品編號 規 格 單位 價格(RMB)
                            pTO-T CL05020 20次 500元
                            pTO-T CL05060 60次 1380元
                                   
                            說明書
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