產品概述：

       pTO-T快速克隆試劑盒利用拓撲異構酶I（Topoisomerase I）的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。適用于克隆由Taq DNA聚合酶擴增的3'端帶有“A”末端的產物。載體元件包含高拷貝的復制子，Amp抗性基因，可以用引物對M13F(-47)和M13R(-48)進行菌落PCR鑒定陽性克隆。

產品組成：

產品特點：

質量控制檢測 ：

       使用本試劑盒連接Control Insert（1kb），涂布于A抗性平板上，用菌落PCR或質粒酶切方法驗證次日長出的克隆，陽性克隆達到總克隆數90%及以上。

貯存

       -20℃保存12個月，避免反復凍融

使用說明

1、連接反應

    按下表，在一個0.2ml PCR管內依次加入

2、反應溫度及片段要求

       室溫下（20℃-30℃）放置5~10分鐘，然后將離心管放置在冰上。當天如不進行轉化實驗，請將連接產物置于-20℃保存。注意DNA片段的用量見下表：

       如果PCR產物電泳檢測僅有單一條帶，無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取產物原液進行克隆。

3、陽性對照反應

       取5ul試劑盒提供的1kb長度的對照片段進行克隆。

4、 轉化

5、 陽性重組子的鑒定

       菌落PCR
       用10ul槍頭挑選克隆至預先加有10ul無菌水或LB培養基的PCR管中，吹打混勻。取2ul細菌懸液為模板，50ul PCR體系中加入10uM濃度的M13F/M13R各1ul進行PCR擴增。
       1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。電泳條帶大小與插入片段大小相近（由于M13引物在克隆位置的兩側，所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大156bp）的克隆可視為陽性克隆。菌落PCR鑒定重組體時一定要設立一個不加菌液的陰性對照，以排除PCR擴增的條帶為假陽性的可能。
       測序：用M13F和M13R對陽性克隆的質粒進行測序分析。

常見問題分析:

轉化次日平板克隆少，或陽性率低？

pTO-T載體圖譜和多克隆位點序列